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　　人免疫抑制酸性蛋白 ( IAP )ELISA 試劑盒

　　( 用于血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和其它生物體液內(nèi) )

　　原理

　　本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心 ABC-ELISA 法。用抗人 IAP 單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的 IAP與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗人 IAP ，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的 Streptavidin 與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍(lán)色，最后加終止液硫酸，在 450nm 處測(cè) OD 值，IAP 濃度與 OD 值成正比，可通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中IAP 濃度。

　　試劑盒組成 ( 2-8 ℃保存)

　　酶標(biāo) 板 (Coated Wells )96 孔酶標(biāo)抗體工作液(Enzyme Conjugate )12ml

　　10 ×標(biāo)本稀釋液(Sample Buffer )12ml20×濃縮洗滌液( Wash Buffer )50ml

　　標(biāo)準(zhǔn)品 (Standards ) ： 8ng/瓶2 瓶底物工作液(TMB Solution )12ml

　　第一抗體工作液( Biotinylated Antibody )12ml終止液 (Stop Solution )12ml

　　準(zhǔn)備試劑與收集血樣

　　1. 收集標(biāo)本：血清、血漿(EDTA )、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、組織勻漿等盡早檢測(cè)， 2-8 ℃ 保存48 小時(shí);更長(zhǎng)時(shí)間須冷凍( -20 ℃或 -70 ℃ )保存，避免反復(fù)凍融。

　　2. 標(biāo)準(zhǔn)品液配制：使用前加入1ml 蒸餾水 混勻，配成 8000p g/ml 的溶液 。 設(shè)標(biāo)準(zhǔn) 管 8 管， 每 管加入標(biāo)本稀釋液 20 0ul 。在第一管中加入 8000p g/ml 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液 2 00ul 混勻后用加樣器吸出 2 00ul ，移至第二 管 。如此反復(fù)作對(duì)倍稀釋?zhuān)瑥牡谄?管 中吸出 2 00ul 棄去。第八 管 為空白對(duì)照。

　　3. 10× 標(biāo)本稀釋液用蒸餾水作 1: 1 0 倍稀釋( 示例： 1ml濃稀釋液 +9ml 蒸餾水)。

　　4. 洗滌液：用重蒸水 1:20 稀釋(示例：1ml 濃縮洗滌液加入 19ml 的重蒸水)

　　檢測(cè)程序

　　1. 加樣：每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品 100ul ，將反應(yīng)板充分混勻后置 37 ℃ 120 分鐘。

　　2. 洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌 4-6 次，向?yàn)V紙上印干。

　　3. 每孔中加入第一抗體工作液10 0ul 。將反應(yīng)板充分混勻后置 37 ℃ 6 0 分鐘。

　　4. 洗板：同前。

　　5. 每孔加酶標(biāo)抗體工作液100ul 。將反應(yīng)板置 37 ℃ 3 0 分鐘。

　　6. 洗板：同前。

　　7. 每孔加入底物工作液100ul ，置 37 ℃ 暗處反應(yīng)15 分鐘。

　　8. 每孔加入100ul 終止液混勻。

　　9. 30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在 45 0 nm 處測(cè) 吸光值。

　　結(jié)果計(jì)算與判斷

　　1. 所有 OD 值都應(yīng)減除空白值后再行計(jì)算。

　　2. 以標(biāo)準(zhǔn)品40 00 、20 00 、100 0 、500 、 250 、 125 、 62.5 、 0 pg /ml 為橫坐標(biāo)， OD 值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上作圖，畫(huà)出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　3. 根據(jù)樣品 OD 值在該曲線圖上查出相應(yīng) IAP 含量。

　　試劑盒性能

　　1. 靈敏度 ： 最小的IAP 檢測(cè)濃度小于 3 0pg/ml。

　　2. 特異性： 可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的人 IAP 。 不與 人其它細(xì)胞因子有交叉反應(yīng)。

　　3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板見(jiàn)變異系數(shù)均小于10%。

　　注意事項(xiàng)

　　1. 以上標(biāo)準(zhǔn)孔及待 測(cè) 樣品均建議做復(fù)孔，每次測(cè)定應(yīng)同時(shí) 做 標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　2. 洗滌過(guò)程 很關(guān)鍵。洗滌不充分將導(dǎo)致精確度誤差及 OD 值錯(cuò)誤地升高。

　　3. 板條開(kāi)封后剩余板條要再封好，保持 板條干燥 。

　　4. 本試劑盒宜置 4 o C冰箱保存。

　　5. 本試劑盒僅用于科研，不能用于臨床診斷!