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ELISA實驗出現(xiàn)“花板”現(xiàn)象大探秘 !
更新時間:2023-08-09瀏覽:617次

  ELISA實驗出現(xiàn)“花板"現(xiàn)象大探秘 !
 

  酶聯(lián)免疫吸附試驗 ELISA(Enzyme Linked ImmunoSorbent  Assay)其原理是抗原或抗體的固相化及抗原抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),由此進行定性或定量分析。該實驗因其靈敏度較高,特異性較好,操作較簡單,可大批量操作而廣泛應(yīng)用于多種傳染性疾病的篩查工作中。然而,“花板"現(xiàn)象的出現(xiàn),往往會給實驗者判讀結(jié)果帶來麻煩。所謂“花板",就是空白、陰性、陽性對照及室內(nèi)質(zhì)控孔結(jié)果正常,而標(biāo)本孔的OD值卻偏高,弱陽性結(jié)果較多。筆者對“花板"現(xiàn)象進行了分析和總結(jié),認為花板原因大多在樣品,解決辦法主要在洗滌,孵育和顯色過程也會導(dǎo)致。

  1、花板原因大多在樣品

  所謂“花板",就是空白、陰陽性對照及室內(nèi)質(zhì)控孔結(jié)果正常,而標(biāo)本孔的OD值卻偏高。之所以空白、對照及質(zhì)控結(jié)果正常而標(biāo)本孔異常,是因為樣品本身的原因,大部分或全部標(biāo)本孔的OD值偏高,很可能是因為樣品中某些共有的物質(zhì)非特異性的吸附于固相載體,而在實驗的過程中未被除去。

  1.1、 待測血清中混有紅細胞或纖維蛋白原 這兩種物質(zhì)易沉淀或附著在聚乙烯孔內(nèi)不易洗凈,實驗表明在較高的離心轉(zhuǎn)速(3000  /min)和較長的離心時間(>10  min)之下,血液標(biāo)本被充分地離心分離之后,使紅細胞和纖維蛋白充分沉淀,可以在加樣時避免加入紅細胞和纖維蛋白,避免這兩種干擾物質(zhì)對實驗結(jié)果的影響,就可避免“花板"情況。

 

血清 試劑盒
 

  1.2、 高IgG血癥 在實際工作中,檢測丙肝的實驗出現(xiàn)花板的情況較多,原因之一是因為目國內(nèi)外的抗-HCV  EIA試劑均采用間接酶聯(lián)免疫檢測原理,間接法的一個重要影響因素是血清中所含的高濃度的非特異性IgG,IgG對聚苯乙烯有較強的吸附力,非特異性IgG可吸附到固相載體上或包被的抗原上造成假陽性。

  2、解決辦法主要在洗滌

  聚苯乙烯因其具有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能而被廣泛用于ELISA實驗的固相載體,聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的,因此需要通過洗滌清除在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。洗滌在  ELISA  過程中雖不是一個反應(yīng)步驟,但卻決定著實驗的成敗。上述提到的血清中存在紅細胞或纖維蛋白原,可以在加樣離心時得到控制,同樣也可以通過適當(dāng)增加洗滌次數(shù)和浸泡時間減輕或避免對實驗結(jié)果的影響,同樣,對于血液存在的非特異性的IgG,實驗者很難在加樣時將其去除,那么解決的時機就是洗滌過程。

  ELISA在洗滌過程中需注意以下幾點:

  (1)、板要平整,尤其是在用洗板機洗板的過程中,往往是3排一起洗,如果板不平,就很可能造成洗液有殘留,從而導(dǎo)致非特異性結(jié)合不能清除干凈,對實驗結(jié)果造成干擾。

  (2)、洗液溫度,實驗表明,洗液溫度也會影響洗板的干凈程度,尤其是冬天溫度過低時容易出現(xiàn)“花板"問題。因此,保持室溫在20℃-30℃。

  (3)、洗液要注滿孔,孔壁洗滌不干凈也易造成“花板"現(xiàn)象。

  (4)、洗液要新鮮配置,洗液要臨用新鮮配制,放置時間過長易產(chǎn)生絮狀物或混濁,造成賭孔或花板。

  (5)、洗板次數(shù)不夠或洗滌間隔時間過短也會造成由于洗板不凈而造成“花板"。

  3、孵育時間過長也會造成“花板"

  實驗室有一段時間經(jīng)常出現(xiàn)丙肝檢測“花板"現(xiàn)象,究其原因是由于樣本較多,加樣后未及時放入孵育箱,反應(yīng)板在室溫呆的時間過長,即間接增加了孵育時間,導(dǎo)致孵育時間過長,蛋白質(zhì)非特異性吸附于固相載體。因此,應(yīng)嚴(yán)格控制加樣時間,加樣后及時孵育,標(biāo)本較多時可分批操作。

  此外,有些廠家的試劑顯色液不穩(wěn)定,使用容易變藍,如在實驗不仔細檢查,很容易導(dǎo)致“花板"現(xiàn)象的發(fā)生,這也提醒實驗者應(yīng)使用新鮮的顯色液,程度的實驗的準(zhǔn)確性。

  綜上所述,將ELISA“花板"現(xiàn)象總結(jié)為:花板原因大多在樣品,解決辦法主要在洗滌,孵育和顯色過程也會導(dǎo)致。既然原因大多在樣品,那么在樣品交接時應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)定,無溶血,無凝血,足量,單個的溶血樣品雖不致造成“花板",但血紅蛋白中的血紅素基團,具有類過氧化物的活性,在以辣根過氧化物酶(horseradish  peroxidase,HRP)為標(biāo)記酶的ELISA測定中,易在孵育過程中吸附于固相,從而與后面加入的底物反應(yīng)顯色,從而造成假陽性。洗滌是ELISA的關(guān)鍵步驟,充分有效的洗滌也是避免“花板"的有利措施。同樣,嚴(yán)格按照試劑說明孵育,使用新鮮的顯色液也是有效避免“花板"的保障。以上措施可以有效減少“花板"次數(shù),從而提高檢測的特異性和準(zhǔn)確性,更好的發(fā)揮ELISA的方法學(xué)優(yōu)勢。

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